【人物与科研】国家纳米科学中心聂广军组与郑大第一附属医院秦志海组合作：组装抗体Fc片段到肿瘤细胞膜上，增强自然杀伤细胞免疫疗法

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导语

抗体依赖细胞介导的细胞毒性（ADCC）作用是一种重要的免疫治疗策略。在ADCC过程中，抗体Fab片段与肿瘤细胞表面抗原结合，而Fc结构域与自然杀伤细胞（NK细胞）膜蛋白的CD16结合，激活NK细胞，启动ADCC。研究者利用利妥昔单抗（Rit，抗CD20单克隆抗体, mAb，人源IgG1）在临床中实现了对淋巴瘤的治疗，这证明ADCC是一种有效肿瘤杀伤策略。然而，实体瘤中抗原异质性和高突变率，令科研人员很难找到一种抗体可对多种类型或亚型肿瘤细胞进行识别，这限制了ADCC在实体瘤治疗中的应用。近日，国家纳米科学中心聂广军研究员课题组与郑州大学第一附属医院秦志海教授合作，在美国亚利桑那州立大学宁波教授、国家纳米科学中心施兴华研究员、王会助理研究员及第二军医大学李威教授等多方协助下，在利用ADCC效应治疗实体肿瘤领域取得了新的进展。

聂广军研究员课题组简介

聂广军，中科院特聘研究员，国科大特聘教授；2002年于中国科学院生物物理研究所获得博士学位，之后在加拿大McGill大学从事博士后研究。2008年回国在国家纳米科学中心建立了“纳米生物学和纳米生物材料”实验室，组建了一个多学科交叉研究团队。课题组现有研究员3名，副研究员3名，助理研究员2名，博新计划博士后2名。课题组已先后获得几十项各类科研资助，主持了多项科技部、基金委、中科院、北京市科委、国际合作项目以及横向合作项目等。与美国、英国、澳大利亚及加拿大等纳米医学和生命科学的多个著名实验室建立了良好的合作关系，先后与6位中科院特聘访问教授开展科研合作。课题组先后培养20名博士、8名博士后、18名硕士。课题组学生先后获得中科院百篇优秀博士论文、研究生（硕士、博士）国家奖学金、中国科学院SABIC-CAS奖学金、中国科学院澳大利亚必和必拓（BHP Billiton）奖学金、中科院三好学生标兵等奖项。

课题组主要结合现代生物学、药学、化学、生物材料以及纳米技术和生物技术手段，研究纳米和生物界面相互作用的基本规律，以及新型纳米材料在生物医学领域的应用。研究领域主要包括肿瘤纳米生物学、纳米生物技术和纳米生物效应等。主要从事的研究方向包括：

（1）肿瘤微环境调控的智能纳米药物； 

（2）膜泡系统的纳米生物效应和药物递送；

（3）生物分子指导的功能性纳米材料设计、构筑和自组装；

（4）发展基于纳米技术和生物技术的代谢疾病和退行性疾病的新型治疗策略。

前沿科研成果

组装抗体Fc片段到肿瘤细胞膜上，增强自然杀伤细胞（NK cells）免疫疗法

近年来，国家纳米科学中心聂广军课题组在利用功能型多肽组装体系针对肿瘤微环境进行调控、成像和治疗方面做了一系列开创性工作。2014年，课题组利用微酸性响应型两亲性多肽构建了肿瘤成像的荧光探针（J. Control Release, 2014, 177, 11-19）。2015年，课题组利用具有治疗效应的多肽组装体，以肿瘤新生血管和肿瘤细胞同时作为治疗靶点，从分子自组装成纳米颗粒以延长血液循环时间，到肿瘤微酸性响应解组装实现分子靶向，实现了对肿瘤生长和转移的双重抑制（Mol. Cancer Ther., 2015, 14, 2390-2400）。同年，课题组利用多聚精氨酸的两亲性多肽组装体对肿瘤相关成纤维细胞（CAF）进行靶向，打破了肿瘤间质及细胞膜等多重药物输运屏障，实现了药物在实体肿瘤的高渗透（Adv. Mater., 2015, 27, 1865-1873）。2016年及2017年，聂广军课题组延续利用功能型多肽参与的组装体系打破肿瘤间质的延误屏障并取得进展（Angew. Chem. Int. Ed., 2016, 55, 1050-1055）。然后，课题组将此思路扩展到间质最为复杂的“癌中之王”——胰腺癌的治疗当中，降低胰腺癌纤维化的程度，可抑制胰腺癌星形细胞的活力，降低细胞外基质（ECM）的分泌，从而增加小分子化疗药物的渗透（ACS Appl. Mater. Interfaces, 2016, 8, 3438-3445; ACS Nano, 2017, 11, 8668-8678）。此外，课题组发现功能型多肽组装体在调控免疫微环境中也起到了独特的作用（Nano Lett., 2018, 18, 3250-3258）。

基于对肿瘤微环境的理解和大量前期工作的基础上，在当今PD1/PDL-1及CAR-T免疫疗法的热潮中，聂广军和秦志海研究团队还关注到了机体内本身就具有杀伤作用的一类免疫细胞，即NK细胞。NK细胞对肿瘤的杀伤主要由ADCC效应产生，但由于实体瘤内肿瘤细胞具有很强的异质性和很高的突变率，仅有极少的单一抗体可以识别多种肿瘤细胞，使得NK细胞免疫在实体瘤的治疗中受到了一定的限制。如果可以直接将治疗性抗体或抗体介导ADCC的Fc片段直接安装到肿瘤细胞膜上，便可能增加NK细胞识别肿瘤细胞的机会。

因此，该研究团队致力于设计不需要抗体-抗原相互作用便能让抗体或Fc片段实现对实体瘤靶向的体系。团队利用具有肿瘤选择性的低pH响应穿膜肽（pHLIP）作为媒介，将可启动ADCC效应的Fc分子或治疗性抗体与pHLIP的N端连接（图1a）；这样，在实体瘤微酸性的环境中，pHLIP发生构象转变并将Fc分子或抗体组装到肿瘤细胞表面（图1b），此方案可能会有效避免抗体不能识别肿瘤细胞而导致的ADCC脱靶（图1c）；当pHLIP将Fc或抗体组装到肿瘤细胞表面后，NK细胞表面的CD16分子识别Fc片段，从而启动ADCC来对肿瘤细胞进行杀伤（图1d）。

图1. pHLIP-Fc或抗体的设计及工作机制

（来源：Advanced Materials）

研究团队首先实现了pHLIP与Fc片段的成功偶连（图1a），且合成的pHLIP-Fc同样保留着与NK细胞膜蛋白CD16（Fc与CD16结合，启动ADCC）结合的能力（图2b）。在微酸性（pH=6.8）条件下，Cy5.5标记的CD16分子可有效识别肿瘤细胞（图1c）。这表明pHLIP-Fc在微酸性的条件下可以有效地将Fc片段安装在肿瘤细胞表面，而在生理中性（pH=7.4）条件下，则不能实现Fc分子的安装。流式细胞技术测试结果表明，微酸性条件下，pHLIP-Fc可在相对较短的时间内，以较高的效率安装到肿瘤细胞上（图2d）。

图2. pHLIP-Fc的合成及功能表征

（来源：Advanced Materials）

随后，研究团队成员将此pHLIP-Fc分子分别在微酸性和中性条件下与肿瘤细胞孵育，随后加入NK细胞。在微酸性环境中，pHLIP-Fc可以有效介导NK细胞对黑色素瘤细胞（B16）和小鼠乳腺癌细胞（4T1）进行杀伤（图3a, b）。此外，研究团队证明pHLIP-Rit可以介导人源NK细胞对人源三阴性乳腺癌进行杀伤（图3c），说明pHLIP修饰的Fc或抗体具有较好的临床应用前景。

图3. pHLIP-Fc或pHLIP-抗体对多种肿瘤细胞的杀伤

（来源：Advanced Materials）

在体内实验中，pHLIP-Fc分子实现了对多种肿瘤（皮下黑色素瘤、原位乳腺癌）的抑制（图4a, b）。免疫组化结果显示，与不能激活NK细胞的对照分子（pHLIP-IgG3）相比，pHLIP-Fc确实可以增加肿瘤组织中激活状态（CRTAM）的NK细胞数量，从而对肿瘤细胞产生杀伤（图4c, d）。

图4. pHLIP-Fc对鼠源和实体瘤的治疗，pHLIP-Fc可有效增加实体瘤组织中激活状态的NK细胞的数量

（来源：Advanced Materials）

此pHLIP-Fc分子在小鼠肺转移瘤模型中也起到了显著地治疗效果，治疗组的肺部转移灶明显减少（图5）。

图5. pHLIP-Fc分子对小鼠肺转移瘤的治疗效果

（来源：Advanced Materials）

综上所述，聂广军课题组与秦志海课题组联合开发了一种可以通过对肿瘤微酸性的响应，靶向多种类型实体肿瘤细胞、且不需要特异性抗体-抗原识别的pHLIP-Fc分子或抗体平台。pHLIP通过构象转变将Fc分子或抗体组装到肿瘤细胞膜上，所安装的分子对NK细胞激活，从而启动ADCC杀伤肿瘤细胞。该策略能显著地对原位实体瘤和转移灶进行抑制，极大地拓宽了ADCC在实体肿瘤免疫治疗中的应用范围。

这一研究成果近期发表在Advanced Materials（DOI: 10.1002/adma.201804395）上，该论文作者为：Tianjiao Ji, Jiayan Lang（共同一作）, Bo Ning（共同一作）, Feifei Qi（共同一作）, Hui Wang, Yinlong Zhang, Ruifang Zhao, Xiao Yang, Lijing Zhang, Wei Li, Xinghua Shi, Zhihai Qin,* Ying Zhao,* and Guangjun Nie*。

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